Moscow, Vavilova str., 43/5 (499) 135-99-57 info@ckpgene.ru
Home / Polymerase chain reaction

Полимеразная цепная реакция была вновь открыта в 1983 году Кэри Маллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи, в 1993г., Маллис получил за неё Нобелевскую премию.

Полимеразную цепную реакцию используют для анализа индивидуальных вариаций последовательности нуклеотидов определенных локусов, для повышения эффективности клонирования целевых последовательностей изучаемых геномов и их прямого секвенирования, для детекции в организме патогенных микроорганизмов и т. п.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований.

Принцип метода:

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

Праймеры- короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18—30 оснований комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

  • Термостабильная ДНК-полимераза— фермент, катализирующий реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов— Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.

Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий

Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись. Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии— 0,5—2 мин. Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

 

Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки.Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 7-10 мин.

 

Количество специфического продукта реакции (ограниченного праймерами) растет экспоненциально, а количество «длинных» копий ДНК линейно, поэтому в продуктах реакции доминирует специфический фрагмент ДНК. Через некоторое количество циклов рост количества продуктов замедляется за счет ограничения количества реагентов, наличия ингибиторов, появления побочных продуктов реакции.

 

ПЦР реального времени (real-time PCR)

Real-time PCR это группа методик, дающие возможность качественного анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени по ходу проведения реакции. Основными этапами данного метода являются:

  • Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.
  • Построение по этим данным кинетической кривой PCR.
  • Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой.

Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы ее генерации различаются в зависимости от конкретного типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR в координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет S-образную форму. В ней можно выделить три стадии:

  • Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).
  • Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).
  • Плато (стадию насыщения).

Исходное количество субстрата определяется по пороговому циклу (threshold cycle) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

 

Варианты real-time PCR различаются по способам генерации репортерной флуоресценции. Два основных используемых в настоящее время способа - это:

  • Применение интеркалирующих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двуцепочечной ДНК,
  • Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных участку PCR-продукта.

Ссылки:
http://molbiol.ru/protocol/12_07_01.html
http://www.weihenstephan.de/gene-quantification/
http://medgen31.ugent.be/primerdatabase
http://www.biotechnolog.ru/ge/ge8_3.htm

Methods and equipment

Spectrophotometry
Transfection
Polymerase chain reaction
Atomic force microscopy
Surface plasmon resonance
Nanotechnology