Принцип метода.
Параметры, клеток регистрируемые при помощи проточного цитометра.
Боковое светорассеяние - side scatter. Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация бокового и прямого светорассеяния позволяет судить о морфологии клетки в целом, выделять различные популяции клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) для дальнейшего анализа. Регистрация флуоресценции. Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флуорохрому. Выбор типа и количества флуоресцентных красителей определяется поставленной зачачей для данного исследования. Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PerCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI)флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), pH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1). Полученные данные обрабатываются компьютером и отображаются в виде одномерных гистограмм или двух- и трехмерных точечных или плотностных графиков. Анализ данных позволяет определить количество клеток, отвечающих тем или иным условиям, оценить интенсивность флуоресценции (т.е. плотность того или иного маркера на поверхности клетки). В некоторых случаях при помощи проточного цитометра можно определить абсолютное число клеток в исследуемом образце.
Преимуществами сортировки клеток на проточном цитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров. Данный метод позволяет отсортировывать любое количество клеток, вплоть до единичных клеток, что является незаменимым в технологиях связанных с клонированием. Проходя через системы прибора клетки подвергаются некоторым неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления) что несколько снижает процент жизнеспособных клеток на выходе по сравнению с исходнам материалом. Также при сортировке на проточном цитометре бывает затруднительным соблюдение абсолютной стерильности, что ограничивает применение данного метода в клинической практике. Некоторые, термины, часто использующиеся в проточной цитометрии.
Дискриминатор. Функция, благодаря которой не регистрируются события, не удовлетворяюшие какому-либо условию. Чаще всего данная функция используется для того чтобы не реристрировать объекты имеющие маленький размел, то есть исключить из анализа частицы разрушенных клеток, тромбоциты, другие мелкие посторонние объекты. Благодаря использованию дискриминатора уменьшается нагрузка на компьютер прибора, повышается его быстродействие, уменьшается размер записываемых файлов, что облегчает последующий анализ данных. Дискриминатор должен быт настроен таким образом, чтобы отсекать большую часть дебриса, но при этом не захватывать область, содержащую интересующие исследователя события. Пробоподготовка образцов. В качестве образцов для исследования на проточном цитометре могут использоваться различные суспензии клеток и биологические жидкости. Для проведения исследования на проточном цитометре необходимо минимизировать количество частиц в исследуемой суспензии, которые могут затруднить анализ. Чаще всего такими частицами являются эритроциты в образцах крови или костного мозга, тогда как объектом исследования выступают лейкоциты. Получение лейкоцитарной суспензии возможно несколькими способами. Во первых можно лизировать эритроциты каким-либо химическим агентом, разрушающим мембрану эритроцита (наиболее распространенным является 0,9% раствор хлорида аммония). Вторым расространенным способом получения лейкоцирарной суспензии является центрифурирование в градиенте плотности (например выделение мононуклеарной фракции из крови при помощи центрифугирования на фиколле). Оба способа имеют свои достоинства и недостатки. Центрифугирование в градиенте плотности не позволяет работать с малыми объемами образцов, но зато в наимешьшей степени влияет на жизнеспособность и функциональную активность клеток. Также при данном способе выделения возможны потери достаточно большого количества клеток из исходного образца. Лизис эритроцитов может быть осуществлен в любом при любых количествах исходного биологического материала, минимизирует риск потери интересующих клеток, проще, дешевле и быстрее в постановке, однако данный метод является более травматичным для клеток и может оказать негативное влияние на их жизнеспособность и морфологические характеристики (клетки могут изменяться в объеме, возможно слущивание с поверхности клеток некоторых антигенов). В случае если требуется сохранение жизнеспособности и функциональной активности клеток следует выбрать выделение в градиенте плотности. Если же требуется произвести большое количество однотипных исследований в которых не выдвигается жестких требований к сохранению функциональной активности клеток следует воспользоваться лизирующим раствором. В том случае, когда объектом исследования является не биологическая жидксть, а культура клеток данный этап пробоподготовки как правило пропускается. Для контроля потери клеток рекомендуется параллельно с исследованием на проточном цитометре производить подсчет лейкоцитарной формулы под миероскопом, особенно это актуально при выделении клеток в градиенте плотности. При некоторых патологических состояниях морфология клеток крови может значительно изменяться, что приводит к значительным потерям при выделении в градиенте плотности и неверным результатам исследований.
Логическое гейтирование. Основной метод анализа цитометрических данных заключается в выделении какой-либо популяции клеток, и дальнейшего анализа событий,относящихся только к интересующей популяции. Гейтирование может производиться по любым регистрируемым параметрам и с использованием любых логических операторов и их комбинаций (И, ИЛИ, НЕ).На представленном примере сперва производится гейтирование по CD45 позитивным событиям выделение лейкоцитарной популяции и отсев дебриса. Следующим шагом идет выделение лимфоцитарной популяции по параметрам прямого и бокового светорассеяния. И уже после двойного гейтирования по CD45 и лимфоцитарному региону происходит заключительный этап анализа - определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов. Ссылки http://ccmi.salk.edu/flow/flowcyt.php http://molbiol.ru/forums/index.php?showforum=82 |
Methods and equipment
Spectrophotometry
Transfection
Flow Cytometry
Polymerase chain reaction
Atomic force microscopy
Confocal microscopy
Surface plasmon resonance
Nanotechnology
Other equipment
|