Принцип метода.

Принцип метода проточной цитометрии основан на регистрации флюоресценции и светорассеяния от каждой отдельно взятой клетки в клеточной суспензии. Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (т.н. гидродинамическое фокусирование).

Клетки одна за другой проходят через лазерный луч, а высокочувствительные детекторы, расположенные вокруг проточной ячейки регистрируют флюоресценцию и рассеяное лазерное излучение каждой клетки. Полученный сигнал передается в компьютер, обрабатывается, и полученные данные отображаются в виде различных графиков и гистограмм.

Параметры, клеток регистрируемые при помощи проточного цитометра.

Прямое (малоугловое) светорассеяние - forward scatter. Детектор прямого светорассеяния располагается по ходу лазерного луча за проточной ячейкой и регистрирует излучение разера, которое рассеивается под углами 2-19 градусов. Интенсивность рассеянного под малым углом света пропорциональна размеру клетки. Более крупные клетки рассеивают свет сильнее мелких.

Боковое светорассеяние - side scatter. Внутреннее содержимое клеток оптически неоднородно. Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Комбинация бокового и прямого светорассеяния позволяет судить о морфологии клетки в целом, выделять различные популяции клеток (лимфоциты, моноциты, гранулоциты) для дальнейшего анализа.

Регистрация флуоресценции. Система для регистрации свечения флюоресцентных меток состоит из комплекса светофильтров и фотоумножителей, каждый из которых регистрирует излучение в диапазоне длин волн, соответствующих флуорохрому. Выбор типа и количества флуоресцентных красителей определяется поставленной зачачей для данного исследования. Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PerCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI)флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), pH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1).

Полученные данные обрабатываются компьютером и отображаются в виде одномерных гистограмм или двух- и трехмерных точечных или плотностных графиков. Анализ данных позволяет определить количество клеток, отвечающих тем или иным условиям, оценить интенсивность флуоресценции (т.е. плотность того или иного маркера на поверхности клетки). В некоторых случаях при помощи проточного цитометра можно определить абсолютное число клеток в исследуемом образце.

Сортировка клеток. В проточном цитометре, оборудованном системой для сортировке клеток, проточная ячейка закреплена на пьезокристалле. При подаче на него напряжения кристалл вместе с ячейкой совершает колебания с заданой частотой, в результате чего струя жидкости с клетками разбивается на отдельные капли. Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержиться внутри капли. Пролетая мимо отклоняющих пластин капля с клеткой притягивается к ним, выходит из основного потока и попадает в пробирку.

Преимуществами сортировки клеток на проточном цитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров. Данный метод позволяет отсортировывать любое количество клеток, вплоть до единичных клеток, что является незаменимым в технологиях связанных с клонированием. Проходя через системы прибора клетки подвергаются некоторым неблагоприятным воздействиям (лазерное излучение, перепады давления) что несколько снижает процент жизнеспособных клеток на выходе по сравнению с исходнам материалом. Также при сортировке на проточном цитометре бывает затруднительным соблюдение абсолютной стерильности, что  ограничивает применение данного метода в клинической практике.

Некоторые, термины, часто использующиеся в проточной цитометрии.

Компенсация. Настройка прибора для исключения паразитного свечения флюорохрома в соседних каналах. Характеристики установленных на проточном цитометре светофильтров таковы, что их область пропускания соответствует максимуму спектра испускания флуорофора. Но за счет того, что спектр испускания флуорофора может быть достаточно широким, часть его излучения может проходить сквозь другие светофильтры, настроенные на регистрацию излучения дрогого флуорофора. То есть к примеру некоторая доля излучения от красителя FITC  будет регистрироваться в канале, предназначенном для фикоэритрина, искажая результаты измерения. Для исключения данного эффетка необходимо уменьшать сигнал с детектора пропорционально сигналу с соседнего детектора, компенсируя таким образом паразитное свечение соседних флуорохромов. Величина компенсации зависит от многих параметров: напряжения на фотоумножителе и как следствие его чувствительности, спектра используемых флуорохромов, производителя реактивов (меченые антитела от разных производителей имеют разное соотношение белок/флуорофора, соответственно одни и те же образцы окрашенные различными антителами будет давать сигналы разной интенсивности).

Дискриминатор. Функция, благодаря которой не регистрируются события, не удовлетворяюшие какому-либо условию. Чаще всего данная функция используется для того чтобы не реристрировать объекты имеющие маленький размел, то есть исключить из анализа частицы разрушенных клеток, тромбоциты, другие мелкие посторонние объекты. Благодаря использованию дискриминатора уменьшается нагрузка на компьютер прибора, повышается его быстродействие, уменьшается размер записываемых файлов, что облегчает последующий анализ данных. Дискриминатор должен быт настроен таким образом, чтобы отсекать большую часть дебриса, но при этом не захватывать область, содержащую интересующие исследователя события.

Пробоподготовка образцов. В качестве образцов для исследования на проточном цитометре могут использоваться различные суспензии клеток и биологические жидкости.  Для проведения исследования на проточном цитометре необходимо минимизировать количество частиц в исследуемой суспензии, которые могут затруднить анализ. Чаще всего такими частицами являются эритроциты в образцах крови или костного мозга, тогда как объектом исследования выступают лейкоциты. Получение лейкоцитарной суспензии возможно несколькими способами. Во первых можно лизировать эритроциты каким-либо химическим агентом, разрушающим мембрану эритроцита (наиболее распространенным является 0,9% раствор хлорида аммония). Вторым расространенным способом получения лейкоцирарной суспензии является центрифурирование в градиенте плотности (например выделение мононуклеарной фракции из крови при помощи центрифугирования на фиколле). Оба способа имеют свои достоинства и недостатки. Центрифугирование в градиенте плотности не позволяет работать с малыми объемами образцов, но зато в наимешьшей степени влияет на жизнеспособность и функциональную активность клеток. Также при данном способе выделения возможны потери достаточно большого количества клеток из исходного образца. Лизис эритроцитов может быть осуществлен в любом при любых количествах исходного биологического материала, минимизирует риск потери интересующих клеток, проще, дешевле и быстрее в постановке, однако данный метод является более травматичным для клеток и может оказать негативное влияние на их жизнеспособность и морфологические характеристики (клетки могут изменяться в объеме, возможно слущивание с поверхности клеток некоторых антигенов). В случае если требуется сохранение жизнеспособности и функциональной активности клеток следует выбрать выделение в градиенте плотности. Если же требуется произвести большое количество однотипных исследований в которых не выдвигается жестких требований к сохранению функциональной активности клеток следует воспользоваться лизирующим раствором. В том случае, когда объектом исследования является не биологическая жидксть, а культура клеток данный этап пробоподготовки как правило пропускается. Для контроля потери клеток рекомендуется параллельно с исследованием на проточном цитометре производить подсчет лейкоцитарной формулы под миероскопом, особенно это актуально при выделении клеток в градиенте плотности. При некоторых патологических состояниях морфология клеток крови может значительно изменяться, что приводит к значительным потерям при выделении в градиенте плотности и неверным результатам исследований.

Неспецифическое связывание антител. На точечной диаграмме неспецифическое связывание выглядит в виде “хвоста”, тянущегося от двойной негативной популяции под углом 45 градусов в верхний правый угол. Неспецифической связывание характерно для образцов с большим содержанием погибших клеток, а также для клеток, имеющих на поверхности Fc-рецептор (в основном, клетки, способные к фагоцитозу). Для борьбы с данным феноменом следует перед окрашиванием антителами обрабатывать клетки специальными реагентами для блокировки Fc-рецептора, проводить подготовку образцов таким образом, чтобы минимизировать гибель и разрушение клеток в процессе пробоподготовки. Также при анализе полученных данных нужно стараться чтобы в регион анализа попадало как можно меньше погибших клеток и дебриса.

Логическое гейтирование.  Основной метод анализа цитометрических данных заключается в выделении какой-либо популяции клеток, и дальнейшего анализа событий,относящихся только к интересующей популяции. Гейтирование может производиться по любым регистрируемым параметрам и с использованием любых логических операторов и их комбинаций (И, ИЛИ, НЕ).На представленном примере сперва производится гейтирование по CD45 позитивным событиям выделение лейкоцитарной популяции и отсев дебриса. Следующим шагом идет выделение лимфоцитарной популяции по параметрам прямого и бокового светорассеяния. И уже после двойного гейтирования по CD45 и лимфоцитарному региону происходит заключительный этап анализа - определение процентного содержания субпопуляций лимфоцитов.

Ссылки

http://ccmi.salk.edu/flow/flowcyt.php

http://molbiol.ru/forums/index.php?showforum=82

http://www.coulterflow.com/bciflow/practical.php

http://flowcytometry.ru